Geochemische Einschränkungen der Bakteriophagen-Infektiosität in terrestrischen Umgebungen

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 78 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lytische Phagen können wirksame und selektive Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums sein und tiefgreifende Auswirkungen auf die Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms haben. Es besteht jedoch Unsicherheit über die biogeochemischen Bedingungen, unter denen Phagenprädation die Funktion mikrobieller Ökosysteme, insbesondere in terrestrischen Systemen, moduliert. Die Ionenstärke ist für die Infektion von Bakterien durch viele Phagen entscheidend, es liegen jedoch nur begrenzte quantitative Daten zu den Ionenschwellenwerten für eine Phageninfektion vor, die mit den Ionenkonzentrationen in der Umgebung verglichen werden können. Auch wenn die Kohlenstoffzusammensetzung in der Umwelt variiert, wissen wir nicht, wie sich diese Variabilität auf die Auswirkungen der Phagenprädation auf die Mikrobiomfunktion auswirkt. Hier haben wir die halbmaximal wirksamen Konzentrationen (EC50) von 80 verschiedenen anorganischen Ionen für die Infektion von E. coli mit zwei kanonischen dsDNA- und ssRNA-Phagen, T4 bzw. MS2, gemessen. Viele Erdalkalimetalle und Alkalimetalle ermöglichten eine lytische Infektion, aber die Schwellenwerte für die Ionenstärke variierten für verschiedene Ionen zwischen den Phagen. Darüber hinaus haben wir anhand eines nitratreduzierenden Süßwassermikrobioms herausgefunden, dass die Fähigkeit lytischer Phagen, die Endprodukte der Nitratreduktion zu beeinflussen, von der Kohlenstoffquelle und der Ionenstärke abhängt. Bei allen Phagen-Wirt-Paaren überstiegen die Ionen-EC50s für eine Phageninfektion die Ionenkonzentrationen, die in vielen terrestrischen Süßwassersystemen gefunden werden. Somit unterstützen unsere Ergebnisse ein Modell, bei dem Phagen den größten Einfluss auf die terrestrische mikrobielle Funktionsökologie an Hot Spots und Hot Moments wie Metazoendärmen, von Dürre beeinflussten Böden oder Biofilmen haben, wo die Ionenkonzentration lokal oder vorübergehend erhöht ist und Nährstoffe zur Unterstützung des Wachstums spezifischer Substanzen verfügbar sind Phagenwirte.

Bakteriophagen sind in natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften allgegenwärtig und können eine wichtige Rolle bei der Modulation des mikrobiellen Elementkreislaufs spielen [1,2,3,4,5,6,7]. Allerdings fehlen uns robuste mechanistische Modelle, um Vorhersagen über die Phagen-Wirt-Dynamik und ökologische Wechselwirkungen zu ermöglichen, insbesondere in komplexen Umgebungen wie Böden und Sedimenten. Während in einigen Studien versucht wurde, einen Einfluss von Phagen auf den Stoffkreislauf im Boden nachzuweisen, sind die Ergebnisse unterschiedlich und offenbar kontextabhängig [1,2,3,4,5]. Daher bleibt das Ausmaß der Auswirkungen der Phagenprädation auf den Elementkreislauf in terrestrischen Ökosystemen und die mechanistische Biogeochemie dieses Prozesses unklar.

In Meeresumgebungen ist die Phagenlyse für etwa 40–50 % der gesamten bakteriellen Mortalität verantwortlich, was ungefähr dem Beitrag der Protozoenprädation entspricht [6]. Kohlenstoff, der nach der Phagenprädation aus toten Bakterienzellen freigesetzt wird, führt zu einem „viralen Shunt“ im marinen Kohlenstoffkreislauf [7]. In terrestrischen Systemen ist der Beitrag von Phagen zur Dynamik des Elementkreislaufs jedoch viel weniger gut charakterisiert und scheint variabler zu sein, insbesondere in extrem heterogenen Umgebungen wie Böden [1,2,3,4,5].

Da es kein mechanistisches Modell der Phagendynamik in terrestrischen Ökosystemen gibt, ist es schwierig, Korrelationen zwischen Bakterien-Viren-Verhältnissen und Umweltparametern zu interpretieren, um kausale Zusammenhänge zu identifizieren [8]. Mehrere Studien haben starke Beziehungen zwischen Wirtsbakterienblüten und räuberischen Phagen in natürlichen Systemen festgestellt [9, 10]. Daraus folgt, dass Umweltparameter, die die Wirtshäufigkeit beeinflussen, für den Erfolg räuberischer Phagen wichtig sind. Beispielsweise kann die Phagenhäufigkeit durch das Vorhandensein essentieller mikrobieller Nährstoffe und Energiequellen beeinflusst werden, die für das Wirtswachstum erforderlich sind (11, 12), wobei das Verhältnis von Virus zu Mikroben mit der mikrobiellen Zelldichte zunimmt (12). Da in Böden Kohlenstoffpartikel oder Wurzelausscheidungen eine höhere mikrobielle Dichte aufweisen, sollten diese daher Hotspots der Phagenprädation sein. Darüber hinaus bestimmt die Qualität des Kohlenstoffs die Zusammensetzung der heterotrophen Mikrobenpopulation [13, 14]. Daraus folgt, dass sich mit der Verschiebung der Kohlenstoffzusammensetzung auch die Häufigkeit phagenempfindlicher Mikrobenpopulationen verschiebt, was den möglichen Einfluss von Phagen auf mikrobielle Elementkreislaufprozesse verändert.

Anorganische Ionengradienten spielen wahrscheinlich auch eine wichtige Rolle bei Phagen-Wirt-Interaktionen in terrestrischen Ökosystemen. Seit fast einem Jahrhundert ist bekannt, dass bestimmte Alkali- und Erdalkalimetalle, darunter Kalzium, Natrium und Magnesium, für die Phageninfektiosität wichtig sind [15, 16]. Dies liegt zum Teil daran, dass diese Kationen mit den Phagenschwanzfasern interagieren, um diese aufzulösen und die Phagenbindung an Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszelle zu ermöglichen [17, 18]. Kationen sind auch wichtig, um negativ geladene Membranen und Phagen zu neutralisieren und die Phagenbindung zu ermöglichen [19, 20]. Die meisten Phagen und Bakterien sind unter neutralen Umgebungsbedingungen negativ geladen [21]. Für Modell-Phagen-Wirt-Paare waren mehr als 1 mM Ca2+ oder Mg2+ oder mehr als 10–40 mM Na+ für eine effiziente Phagenbindung erforderlich [19]. Kationen sind über ähnliche Ladungsneutralisierungsmechanismen auch wichtig für die Phagenretention auf Boden- und Sedimentpartikeln [20, 22, 23]. Die Membranflüssigkeit wird auch durch die Ionenstärke beeinflusst [24] und dies kann die Phagenrezeptorbindung verändern, insbesondere bei Phagen, die an Lipide der äußeren Membran binden. Außerdem reagiert die Persistenzlänge von in Phagen verpackter DNA sehr empfindlich auf Änderungen der Ionenstärke, wobei eine stärker ungeordnete DNA bei niedrigerer Ionenstärke wahrscheinlich die Infektiosität beeinträchtigt [25,26,27]. Schließlich wird die Expression einiger Phagenrezeptoren bei höherer Ionenstärke induziert. Der T4-Phagenrezeptor OmpC wird bei Ionenstärken zwischen 10–500 mM hochreguliert [28] und der MS2-Rezeptor, der konjugative Pilus Typ 1, wird mit zunehmender Ionenstärke in ähnlicher Weise hochreguliert [29]. Daher gibt es viele Hinweise darauf, dass es umweltrelevante Ionenschwellenwerte gibt, unterhalb derer die Phagenprädation einen geringeren Einfluss auf Mikrobiome hat. Wir gingen davon aus, dass die Ermittlung dieser Schwellenwerte in gut kontrollierten Laborsystemen wertvolle Einschränkungen für Modelle der mikrobiellen Umweltökologie liefern würde.

Die Messung von Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen geochemischen Parametern und mikrobieller Ökologie erfordert Hochdurchsatzansätze zur Simulation und Rekapitulation von Umweltbedingungen unter kontrollierten Laborbedingungen [14, 30, 31]. Bakterien und Phagen können in weiten Bereichen der Ionen- und Kohlenstoffkomplexität und -konzentration bestehen bleiben, und in einigen Studien wurden Korrelationen zwischen der Virus-Wirt-Dynamik und Umweltparametern beobachtet [8]. Allerdings fehlt uns ein detailliertes mechanistisches Verständnis darüber, wie komplexe natürliche Umweltgradienten von Kohlenstoff und anorganischen Ionen die Phagenprädation beeinflussen. Darüber hinaus erschwert die Verwendung nicht standardmäßiger Medien in früheren Laborstudien mit niedrigem Durchsatz und niedriger Auflösung [15, 16, 17, 18, 19, 32] systematische Vergleiche.

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass die Art und Konzentration von Ionen und Kohlenstoffquellen in einem mikrobiellen Ökosystem wichtige Kontrollen für die Phagen-Wirt-Dynamik sind, und entwickelten Laborexperimente, um diese Einflüsse auf Modell-Phagen-Wirt-Wechselwirkungen zu messen. Wir verwendeten die Modellinteraktion zwischen T4- und MS2-Phagen und E. coli-Wirten, um die Schwellenwerte anorganischer Ionen für die Phageninfektiosität zu quantifizieren. Wir verwendeten auch ein kultiviertes nitratreduzierendes Mikrobiom aus aquatischem Süßwassersediment, um die Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen Kohlenstoffzusammensetzung, anorganischer Ionenkonzentration und lytischem Phagen bei der Kontrolle des mikrobiellen Elementkreislaufs zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft und die Atmungsaktivität empfindlich auf Änderungen in der Zusammensetzung und Konzentration sowohl der Kohlenstoffquellen als auch der anorganischen Ionen reagieren. Insbesondere haben wir beobachtet, dass Phagen das Wachstum und die Stoffwechselaktivität von Populationen einschränken können, die eine dominante Elementkreislauffunktion (dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammonium, DNRA) ausüben, dass die Phagenprädation jedoch davon abhängt, dass beide über eine Kohlenstoffquelle verfügen, die von ihnen genutzt werden kann DNRA-Population und anorganische Ionenkonzentrationen über denen, die in den meisten terrestrischen Süßwasserumgebungen beobachtet werden. Daher schlagen wir ein mechanistisches Modell vor, bei dem die Phagenprädation in terrestrischen Systemen überwiegend an Hotspots stattfindet, an denen ausreichend Nährstoffe vorhanden sind, um das Wirtswachstum zu fördern, und anorganische Ionen lokal oder vorübergehend konzentriert sind.

Um den Einfluss anorganischer Ionen auf Phagen-Wirt-Wechselwirkungen zu quantifizieren, haben wir zunächst das Wachstum von zwei Modell-E. coli-Stämmen, BW25113 (dem Wirt für den dsDNA-Phagen T4) und C3000 (dem Wirt für den ssRNA-Phagen MS2), in Gegenwart gemessen einer Anordnung von 80 verschiedenen seriell verdünnten anorganischen Ionen unter Verwendung einer Hochdurchsatz-Assay-Plattform [30, 31]. Anschließend haben wir das Wachstum dieser Wirtsstämme über das anorganische Ionenarray in Gegenwart ihrer entsprechenden lytischen Phagen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 Phagen pro Bakterienzelle gemessen (Abb. 1A). Wichtig ist, dass wir für unsere Kontrollkulturen ein ionenarmes, chemisch definiertes Medium verwendeten, das ~30 mM Na+ und submillimolare Konzentrationen anderer Spurenelemente und Ionen enthielt. In diesem ionenarmen Medium wurde das Wachstum von E. coli durch die Zugabe von lytischem Phagen nicht gehemmt. So konnten wir beobachten, dass viele anorganische Ionen in Gegenwart und Abwesenheit von Phagen ähnliche Hemmwirkungen (IC50) zeigten (Tabelle S1). Allerdings zeigten mehrere Erdalkalimetalle und Alkalimetalle in Gegenwart von Phagen eine niedrigere halbmaximale Hemmkonzentration (Abb. 1B, C). Diese in Gegenwart von Phagen gemessenen geringeren Hemmwirkungen stellen die wirksame Konzentration dar, die für eine Phageninfektion erforderlich ist (EC50). Wir bemerkten auch einen subtilen, aber reproduzierbaren Anstieg des IC50 von Al3+ in Gegenwart des T4-Phagen (Abb. 1B, C). Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass Phagen Bakterien in Umgebungen mit hohen Konzentrationen an Übergangsmetallen vor Metalltoxizität schützen können.

A Um den Einfluss anorganischer Ionen auf die Phagenprädation zu messen, werden Bakterienwirte in einem ionenverarmten, chemisch definierten Medium in Gegenwart und Abwesenheit von Phagen und in Gegenwart und Abwesenheit einer Reihe anorganischer Ionen, die in Mikrotiterplatten seriell verdünnt werden, gezüchtet. Halbmaximale Hemmkonzentrationen werden in Gegenwart und Abwesenheit von Phagen quantifiziert, um die Schwellenwerte für die Ionentoxizität (IC50) und die für eine Phageninfektion erforderlichen Ionenschwellenwerte (EC50) zu ermitteln. B Wachstum von E. coli BW25113-Kulturen nach 12 Stunden, gemessen anhand der optischen Dichte (OD 600) in Gegenwart (geschlossene Symbole) oder Abwesenheit (offene Symbole) von T4-Phagen und unterschiedlichen Konzentrationen von Ca2+ und Al3+ im Vergleich zu Kontrollkulturen ohne Phagen oder zusätzliche Ionen. C Vergleich des ausgewählten Ions IC50 oder Phagen-Ions EC50 für E. coli BW25113 und Phagen T4 (schwarz) und für E. coli C3000 und Phagen MS2 (rot). Geschlossene Symbole zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen IC50/EC50 in Abwesenheit/Anwesenheit von Phagen an. D EC50 ausgedrückt als Ionenstärke für Ionen, die eine lytische Phageninfektion ermöglichen (offene Symbole = Alkalimetalle, geschlossene Symbole = Erdalkalimetalle).

Unsere Dosis-Wirkungs-Analysen zeigen, dass die wichtigsten zweiwertigen Erdalkalimetalle (Ca2+ und Mg2+) und einwertigen Alkalimetalle (K+ und Na+), die in natürlichen Gewässern vorkommen, eine lytische Infektion durch T4 und MS2 ermöglichen (Abb. 1C, D). Von den weniger verbreiteten Ionen in natürlichen Gewässern ermöglichten Sr2+ und Li+ eine effiziente Phageninfektion, während Be2+, ​​Rb+ und Cs+ in Gegenwart und Abwesenheit von Phagen toxischer waren und ähnliche Hemmwirkungen aufwiesen. Cs+ und Rb+ beeinträchtigen wahrscheinlich den K+-Metabolismus [33, 34], während Be2+ den kleinsten Ionenradius und die negativste Elektronenaffinität der von uns getesteten Alkalimetalle/Erdalkalimetalle aufweist. Im Allgemeinen erforderte der MS2-Phage eine geringere Ionenstärke als für eine T4-Infektion (Abb. 1C, D). Von den Ionen, die eine lytische Phageninfektion ermöglichen, erforderten die einwertigen Ionen höhere Konzentrationen, selbst wenn der durch die zweiwertigen Ionen verursachte Unterschied in der Ionenstärke korrigiert wurde (Abb. 1D). Beispielsweise war der Ca2+-EC50-Wert sowohl für MS2 als auch für T4 deutlich niedriger als der Na+-EC50-Wert. Andere haben sowohl über spezifische als auch unspezifische Ionenanforderungen für Phagen berichtet [35,36,37,38,39,40,41]. Im Vergleich zu diesen früheren Studien zeigen unsere Ergebnisse und Methoden jedoch eine klare Ionenspezifität über ein breiteres Spektrum an anorganischen Spezies und Konzentrationsbereichen. Somit zeigen unsere Ergebnisse, dass sich Phagen in ihren Anforderungen an die Ionenstärke unterscheiden und dass sowohl bei MS2- als auch bei T4-Phagen die Art des anorganischen Ions, das zur Ionenstärke beiträgt, die für die lytische Infektion erforderliche Ionenkonzentration beeinflusst. Nur eine kleine Untergruppe von Ionen (Ca2+, Mg2+, K+, Na+, Sr2+, Li+) ermöglicht eine lytische Phageninfektion bei Konzentrationen, die unter der direkten Ionentoxizität für Zellen liegen.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Ionenstärke auch die Phagen-Wirt-Wechselwirkungen und den mikrobiellen Elementkreislauf in komplexeren Mikrobiomen steuert. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir eine modellhafte nitratreduzierende mikrobielle Anreicherungskultur aus aquatischem Süßwassersediment (FN-Anreicherungskultur). Dieses kultivierte Mikrobiom verfügt über verschiedene heterotrophe Bakterien mit ausgeprägten und unterschiedlichen Atmungsfähigkeiten, darunter sowohl Denitrifikatoren als auch Bakterien, die zur dissimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium (DNRA) fähig sind. Zuvor haben wir dieses Mikrobiom verwendet, um zu zeigen, dass bestimmte Kohlenstoffquellen die Endprodukte der mikrobiellen Nitratreduktion beeinflussen können, indem sie selektiv Mikrobenstämme mit besonderen respiratorischen Enzymfähigkeiten anreichern [14]. Aus unserer früheren Arbeit [14] haben wir Reinkulturisolate aus dieser Anreicherung, darunter einen Escherichia- und zwei Citrobacter-Stämme, die je nach primärem Elektronendonor/Kohlenstoffquelle bei der Katalyse von DNRA dominieren können. Um den Phageneinfluss auf die Struktur und Funktion des DNRA-Mikrobioms zu beurteilen, isolierten und charakterisierten wir dsDNA-Phagen, die entweder Escherichia- oder die beiden Citrobacter-Isolate jagen können (Abbildung S1).

Als nächstes stellten wir einen Cocktail aus drei Phagenisolaten zusammen, die jeweils zur lytischen Infektion eines der dominanten DNRA-Organismen in der Anreicherungskultur, zwei Citrobacter und eines Escherichia, fähig sind, und maßen den Einfluss dieses Phagencocktails auf die Ammoniumproduktion und die Stammzusammensetzung der Anreicherungskultur (Abb. 2, Abbildung S2). Wir testeten die Zugabe des Phagencocktails zur Anreicherungskultur, die auf verschiedenen Kohlenstoffquellen/Elektronenspendern gewonnen wurde (Abb. 2A) und stellten fest, dass die Wirkung von Phagen bei einigen Kohlenstoffquellen größer war als bei anderen (Abb. 2B, C). Bei Kohlenstoffquellen, in denen die Escherichia- oder Citrobacter-Stämme dominieren, wie D-Trehalose, D-Glucose oder D,L-Lactat, war die Ammoniumproduktion in Gegenwart des lytischen Phagencocktails signifikant verringert (ANOVA, p < 0,05) ( Abb. 2B, Abbildung S2). Dies entsprach einem subtilen, aber signifikanten Rückgang der relativen Häufigkeit mindestens eines der dominanten DNRA-Organismen. Im Gegensatz dazu führten in D-Cellobiose und L-Sorbose gezüchtete Kulturen zu einer Klebsiella, die nur zur Nitratreduktion zu Nitrit fähig ist. Weder die DNRA-fähigen Citrobacter noch die Escherichia nutzen D-Cellobiose oder L-Sorbose, weshalb die Ammoniumakkumulation bereits in Abwesenheit von Phagen gering war und die Zugabe der Phagencocktails nur geringe Auswirkungen auf die Ammoniumproduktion hatte. Schließlich wird mit Ethanol und Formiat ein Sulfurospirillum angereichert, das DNRA-fähig ist. In diesen Kulturen wurde die Ammoniumakkumulation größtenteils durch einen Stamm verursacht, auf den der lytische Phagencocktail nicht abzielte, und wurde daher durch die Phagenzugabe nicht beeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fähigkeit lytischer Phagen, die Struktur und Funktion des Mikrobioms zu beeinflussen, von der Wachstumsfähigkeit der Wirte abhängt, die wiederum durch Veränderungen der Nährstoffe wie Elektronendonoren und Kohlenstoffquellen gesteuert wird.

Das genomisch charakterisierte Nitrat-reduzierende Mikrobiom AA wird in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen in Gegenwart und Abwesenheit eines Phagencocktails gewonnen, der so formuliert ist, dass er auf die DNRA-Funktion im Mikrobiom abzielt. Ammonium und die Zusammensetzung der Gemeinschaft werden gemessen, um den Einfluss jeder Kohlenstoffquelle auf die Phagenmodulation der mikrobiellen Elementkreislauffunktion zu bestimmen. B Ammoniumproduktion, genetisches DNRA-Potenzial und relative Häufigkeit dominanter Stämme im FN-Mikrobiom auf ausgewählten Kohlenstoffquellen. Box und Whisker stellen den Interquartilbereich dar. Die schattierten Felder zeigen signifikante Unterschiede (ANOVA, p < 0,05) zwischen Plus- (+) und Minus- (-) Phagenbedingungen. Im gestapelten Balkendiagramm: Dunkelblau = Escherichia, Grün = Citrobacter, Rot = Klebsiella, Orange = Sulfurospirillum, Hellblau = Pseudomonas, Schwarz = Gram-positive Fermenter, Grau = andere Stämme. C Ammoniumproduktion durch das FN-Mikrobiom, das auf verschiedenen Kohlenstoffquellen in Gegenwart und Abwesenheit eines Phagencocktails gezüchtet wurde. Die Farben der Punkte spiegeln den dominanten Stamm wider, der an jeder Kohlenstoffquelle angereichert ist, und stimmen mit dem Farbschema in Panel A überein ionenarme Kontrollkulturen.

Um zu testen, ob die Ionenstärke die Fähigkeit unseres lytischen Phagencocktails beeinflusst, die DNRA-Funktion der mikrobiellen Anreicherungskultur im Süßwasser zu modulieren, haben wir die Anreicherung auf D-Trehalose in einem Medium mit niedriger Ionenstärke (~40 mM Na+) und unterschiedlichen Konzentrationen an Na+ gezüchtet oder Ca2+ (Abb. 2D). D-Trehalose wird von verschiedenen Bodenmikroorganismen, einschließlich Enterobakterien, als Osmoprotektivum unter Dürrebedingungen produziert [42]. Somit kann dieses Experiment die physiologischen Zustände simulieren, denen Enterobakterien in Böden ausgesetzt sind, wenn der Wassergehalt und die Ionenstärke variieren. Auch die Ammoniumkonzentrationen in D-Trehalose-Kulturen reagierten äußerst stark auf die Zugabe des lytischen Phagencocktails. Wir haben sowohl das Wachstum als auch die Ammoniumakkumulation dieser Kulturen als Funktion der Na+- oder Ca2+-Konzentration gemessen. Wir fanden heraus, dass beide Ionen die Ammoniumakkumulation in Gegenwart von Phagen in geringeren Konzentrationen hemmen als in Abwesenheit von Phagen, was ihre Bedeutung für die lytische Phageninfektion in diesem Modell-Süßwassermikrobiom zeigt. Darüber hinaus waren die EC50 dieser Ionen gegen die FN-Kultur ähnlich denen, die für MS2 oder T4 gemessen wurden (Abb. 1).

Nachdem wir die Ionen-EC50-Schwellenwerte für die Infektion bakterieller Wirte mit lytischen Phagen gemessen haben, fragten wir uns, ob diese Konzentrationen in terrestrischen Süßwassern erreicht werden. Die Na+-, Ca2+- und Mg2+-Konzentrationen in Süßwasser variieren um mehr als drei Größenordnungen, von Quellwasser mit geringer Ionenstärke [43] bis zu landwirtschaftlichem Entwässerungswasser mit hoher Ionenstärke [44] (Abb. 3), aber die Ionenkonzentrationen sind im bakteriellen Zytoplasma viel höher [ 45], der menschliche Darm oder Meerwasser [46]. Für Na+ erreichte keines der Süßwasser die notwendigen Ionenkonzentrationen, die für eine von uns gemessene lytische Phageninfektion erforderlich sind (Abb. 3A), aber die Na+-Konzentrationen im bakteriellen Zytoplasma, im menschlichen Darm oder im Meerwasser überschreiten die von uns gemessenen Schwellenwerte für eine Phageninfektion. Sowohl für Ca2+ als auch für Mg2+ erreichten einige der landwirtschaftlich genutzten Wässer mit extrem hoher Ionenstärke aus entwässerten Böden die für eine MS2-Infektion erforderlichen Ionenkonzentrationen, jedoch nicht die für T4 oder den nitratreduzierenden Anreicherungskultur-Phagencocktail im Süßwasser erforderlichen Konzentrationen (Abb. 3B). , C). Im Meerwasser überstiegen die Ca2+- und Mg2+-Konzentrationen den EC50-Wert des MS2-Phagen und im bakteriellen Zytoplasma überstiegen die Mg2+-Konzentrationen den EC50-Wert des MS2-Phagen.

Vergleich der Ionen-EC50-Werte für MS2, T4 und Süßwasser-Nitrat-atmendes Mikrobiom (FN)-Phagencocktail mit Konzentrationen der Hauptionen in verschiedenen Süßwasserarten, dem bakteriellen Zytoplasma, dem menschlichen Darm oder Meerwasser A. Na+, B. Ca2+ und C. Mg2+. (Referenzen finden Sie im Haupttext).

Insgesamt lassen unsere Ergebnisse zusammen mit denen in der Literatur vermuten, dass die geringe Ionenstärke in vielen Süßwasserumgebungen eine erfolgreiche lytische Phageninfektion für die von uns untersuchten enterobakteriellen Phagenwirtspaare einschränken könnte. Im Gegensatz dazu stellt die Ionenstärke in metazoischen Därmen, in Biofilmen neben kürzlich lysierten Zellen oder in Mündungs-/Meeresumgebungen keine Einschränkung für diese Phagen-Wirt-Wechselwirkungen dar. Während adaptierte Phagen mit geringer Ionenstärke existieren können, wird unser Vorschlag durch Ionen-EC50 gestützt, die für andere Boden- und Süßwasser-Umweltphagen der Gattungen Bacillus und Rhodopseudomonas gemessen wurden [39,40,41]. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Bacillus-Phagen Kationen benötigen, die über denen liegen, die in vielen Wassersystemen vorkommen (~1–10 mM Ca2+ oder Mg2+, ~50–100 mM Na+), um eine maximale Infektiosität zu erreichen [41, 47]. Außerdem wurde gezeigt, dass Phagen des Modell-Süßwasserbakteriums Caulobacter Mg2+ in einer Menge von ~ 1 mM benötigen [48, 49]. Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung verschiedener Phagenstudien kam zu dem Schluss, dass für eine wirksame Infektion durchschnittlich 2,38 mM Ca2+, 5,08 mM Mg2+ oder ~100 mM Na+ erforderlich waren [32]. Alle diese Messungen stimmen mit dem klassischen theoretischen Modell überein, dass für die Phagenbindung eine Neutralisierung der Membranladung erforderlich ist und dass diese bei zweiwertigen Kationen (z. B. Ca2+ oder Mg2+) bei >1 mM und bei einwertigen Kationen (z. B. Na+) bei >10 mM erfolgt ) [19, 20]. Wichtig ist, dass diese Konzentrationen höher sind als in vielen Süßwassergewässern (Abb. 3). Tatsächlich beträgt die globale mittlere Ca2+-Konzentration in Süßwasser etwa 0,1 mM und nimmt aufgrund der anthropogenen Versauerung ab [50]. Während die meisten Phagenlysemedien auf hohen Konzentrationen der wahrscheinlich unphysiologischen Ionen Ca2+ oder Mg2+ basieren, deuten unsere Daten darauf hin, dass Na+ möglicherweise tatsächlich ein wichtigeres Ion für die Ermöglichung einer Phageninfektion in vielen Süßwassergewässern ist, da die Ca2+- oder Mg2+-Konzentrationen häufig zu niedrig sind zur Unterstützung einer lytischen Phageninfektion. Zukünftige Arbeiten sollten sich auf die Messung der Ionenschwellen für mehr Phagen mithilfe standardisierterer Techniken konzentrieren, wie wir sie in dieser Studie vorgestellt haben, um zu bestimmen, inwieweit Ionen ein steuernder Faktor für deren ökologische Reichweite sind. Darüber hinaus wird die Bewertung des Einflusses komplexerer Mischungen anorganischer Ionen und pH-Gradienten auf die Phageninfektion mithilfe von Hochdurchsatzansätzen, wie wir sie in dieser Studie entwickelt haben, dazu beitragen, die komplexen Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen geochemischem Kontext und Phagen:Wirt-Dynamik zu charakterisieren.

Unser Vorschlag, dass die meisten Süßwasserumgebungen für eine erfolgreiche Phageninfektion nicht optimal sind (Abb. 3), steht angeblich im Widerspruch zur Prävalenz von Phagen in einigen terrestrischen Böden (51) und Seen (8, 52). Allerdings gibt es in diesen Umgebungen Orte und Zeiten, an denen die Ionenkonzentrationen lokal oder vorübergehend die für erfolgreiche Phagen-Wirt-Interaktionen erforderlichen Schwellenwerte überschreiten. Wir schlagen vor, dass diese „Hot Spots“ und „Hot Moments“ kritische Orte einer Phageninfektion sind und in unseren konzeptionellen Modellen der Phagenökologie berücksichtigt werden sollten (Abb. 4, Abbildung S3).

A Hauptionenkonzentrationen im Zytoplasma als Funktion der Diffusionsentfernung von lysierten E. coli-Zellen im Vergleich zu den EC50-Konzentrationen, die für eine T4-Phageninfektion erforderlich sind (gestrichelte Linien). B Hauptionenkonzentrationen in einem typischen Quellwasser der Sierra Nevada während der Verdunstung als Funktion des Konzentrationsfaktors im Vergleich mit Phagen EC50. Der Konzentrationsfaktor ist das Verhältnis des anfänglichen Wasservolumens zum nach der Verdunstung verbleibenden Volumen. Die Farben zwischen EC50 und Ionenkonzentrationslinien sind konsistent. Farben und Symbole sind die gleichen wie in Tafel A. C Konzeptuelles Modell für Phageninfektion. Die Ionenstärke in Süßwasserumgebungen ist zu gering, um eine Phageninfektion zu fördern. Eine höhere Ionenstärke findet sich im Darm von Metazoen oder im Brack-/Meereswasser und wird vorübergehend in von Dürre beeinflussten Böden oder in einem Biofilm neben einer lysierten Zelle beobachtet. Wenn andere Stämme (blau) vorhanden sind, beispielsweise wenn sich der dominante Elektronendonor/die Kohlenstoffquelle oder andere Nischendimensionen verschieben, finden weniger produktive Phagen-Wirt-Wechselwirkungen statt.

In bakteriellen Biofilmen wird durch die Diffusion von Ionen aus dem Zytoplasma von durch Phagen lysierten Bakterienzellen lokal eine ausreichende Ionenstärke für die Infektion neuer Wirte aufrechterhalten. Wir können die Diffusion dieser Ionen aus Zellen modellieren (Abb. 4A). Wir wissen, dass die Ionenkonzentrationen in bakteriellen Zytoplasmen ~212 mM Na+, 38 mM K+, 0,5 mM Ca2+, 1 mM Mg2+ betragen und eine Zelle als Kugel mit einem Radius von einem Mikrometer angenähert werden kann. Somit können wir berechnen, wie diese Konzentrationen abnehmen, wenn sie gleichmäßig in größere Volumina diffundieren. Unsere Analyse zeigt, dass bei einer Entfernung von ca. 1 Mikrometer von lysierten Zellen die Konzentration von Na+ unter den EC50-Wert für eine erfolgreiche lytische Infektion durch T4-Phagen sinkt (Abb. 4A). Dies lässt darauf schließen, dass Phagenblüten in Biofilmen durch eine sehr lokale Diffusionsdynamik zwischen benachbarten Zellen verbreitet werden. Interessanterweise beginnt der T4-Phage bei Konzentrationen nahe der lytischen Infektion EC50 für Na+ zu aggregieren [17]. Da Phagenaggregate gegenüber Umweltstressoren stabiler sind, könnte dies darauf hindeuten, dass sich Phagen entwickelt haben, um außerhalb von Bakterienwirten bei geringer Ionenstärke zu überleben, wenn eine Infektion ungünstig ist.

Während der Dürre werden ionische gelöste Stoffe im Porenwasser des Bodens konzentriert, bis die Löslichkeitskonstanten (Ksp) für unlösliche anorganische Verbindungen überschritten werden (Abb. 4B). In vielen Süßwassersystemen begrenzt die Bildung von Magnesiumsilikaten und Calciumcarbonaten die Löslichkeit von Ca2+ und Mg2+. Na+- und K+-Salze sind viel löslicher und daher steigt die Konzentration dieser Ionen linear mit dem Konzentrationsfaktor (der Konzentrationsfaktor ist das Verhältnis des anfänglichen Wasservolumens zum nach der Verdampfung verbleibenden Volumen. Ein Konzentrationsfaktor von 3 bedeutet dies 1/3 des ursprünglichen Wassers bleibt übrig). Ionenkonzentrationen bei der Verdunstung eines typischen Quellwassers (Sierra Nevada Mountain Springwater, CA) wurden modelliert [53] und wenn wir den T4-Phagen EC50 über die Ionenkonzentrationsprofile legen, stellen wir fest, dass eine 100- bis 1000-fache Konzentration dieses Wassers erforderlich ist damit Phagen infizieren können.

Auf der Grundlage unserer Ergebnisse und Präzedenzfälle aus der Literatur schlagen wir daher ein Modell vor, bei dem eine Phageninfektion am stärksten begünstigt ist, wenn die Ionenstärke lokal oder vorübergehend erhöht ist (Abb. 4C). Einige aktuelle Feldbeobachtungen stimmen mit unserem Modell überein. Metagenomische Untersuchungen von Böden deuten auf einen starken Einfluss der Bodenfeuchtigkeit auf die virale ökologische Dynamik hin [54,55,56]. Beispielsweise wurde eine starke Beziehung zwischen Distanz und Zerfall bei der Ähnlichkeit zwischen Viruspopulationen auf einem Grünlandfeld beobachtet [54]. Dies könnte durch die starken Einschränkungen der Virusverbreitung erklärt werden, die wir erwarten, wenn die Ionenkonzentrationen im Süßwasser zu niedrig sind, um eine Infektion zu ermöglichen. Andere Studien haben einen starken Einfluss des Bodenfeuchtigkeitsgehalts auf den Inhalt der Virusgemeinschaft beobachtet [55], dies könnte jedoch den bekannten Einfluss von Dürre auf die Zusammensetzung der Mikrobengemeinschaft widerspiegeln [57, 58]. Andere Felddaten stützen unser Modell und gehen davon aus, dass Dürre eine direkte Rolle bei der Bekämpfung von Phageninfektionen spielt. Kürzlich wurde in einem Zeitverlauf von einem Boden, der nach einer Dürreperiode wiedervernässt wurde, Phagen-DNA in den ersten Stunden nach einem Regenereignis beobachtet [59]. Basierend auf unseren Beobachtungen lässt sich diese schnelle Phagenblüte am besten durch eine Phageninfektion erklären, die in den frühen Phasen der Dürre auftritt, wenn sich der Stoffwechsel des Wirts verlangsamt, wobei die Phagenreplikation bei der Wiedervernässung erfolgt und durch die Wiederbelebung des bakteriellen Stoffwechsels des Wirts erleichtert wird. Eine sorgfältige Feldforschung zur Messung der Ionenkonzentrationen im Bodenporenwasser und der Phagen-Wirt-Dynamik über einen vollständigen Nass-Trocken-Nass-Zyklus wäre hilfreich, um diese Hypothese weiter zu stützen.

Ein weiteres Merkmal unseres konzeptionellen Modells der Phagenprädation besteht darin, dass die Anreicherung von Nicht-Wirtsbakterien die Wahrscheinlichkeit produktiver Phagen-Wirt-Wechselwirkungen verringert. Unsere Experimente mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen stützen dieses Modell. Wir beobachteten, dass bei der Anreicherung von Sulfurospirillum oder Klebsiella in unseren Kulturen die räuberische Effizienz der Escherichia- und Citrobacter-Phagen sowie der Einfluss der Phagen auf die DNRA-Aktivität verringert wurden. Daraus folgt, dass präbiotische Nährstoffzusätze potenziell wichtig sind, um die Wirksamkeit von Phagencocktails zu steigern, und dass mit zunehmender Kohlenstoffkomplexität (z. B. in Böden) die Phagenprädation wahrscheinlich weniger wichtig für die Vermittlung der Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms ist. Wir gehen davon aus, dass weitere Arbeiten zur Beurteilung, wie die Nährstoffkomplexität die Phagen-Wirt-Interaktionen in natürlichen Systemen beeinflusst, wichtig sein werden, um diese Hypothese zu stützen.

Das Verständnis der Umweltkontrollen auf die Phagenökologie ist für ein prädiktives Verständnis der Auswirkungen der Virusfraktion auf den biogeochemischen Kreislauf in terrestrischen Ökosystemen von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus besteht Optimismus hinsichtlich des Einsatzes von Phagen und anderen genetischen Bearbeitungstechnologien zur Kontrolle und Manipulation mikrobieller Ökosysteme. Daher ist es wichtig, die Bedingungen zu berücksichtigen, unter denen die phagenbasierte Mikrobiomtechnik erfolgreich sein wird. Mit Verbesserungen unserer Fähigkeit, Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen Umweltparametern zu simulieren, können wir unseren Modellen der mikrobiellen Dynamik in komplexen terrestrischen Systemen wichtige Einschränkungen hinzufügen. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung von Modellmikrobiomen mit geringer Komplexität, die archiviert, genomisch charakterisiert und in Laboratorien im Hochdurchsatz manipuliert werden können, wichtige Erkenntnisse darüber liefern wird, wie selektive Drücke die Mikrobiomstruktur und die Funktion des Elementkreislaufs beeinflussen.

Um den Einfluss anorganischer Ionen auf das Wachstum von E. coli in Gegenwart von T4-Phagen zu quantifizieren, verwendeten wir ein Kulturmedium mit niedriger Ionenstärke, das 30 mM PIPES-Puffer pH 7, 5 mM Ammoniumchlorid, 1 mM Natriumphosphat, 1 mM L- enthielt. Cystein, 30 mM D-Glucose und DL-Vitamine und Mineralien. Alle Chemikalien stammen von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Die endgültige Na+-Konzentration in diesem Medium betrug ~30 mM. In diesem Kulturmedium waren Phagen nicht in der Lage, E. coli in Kontrollkulturen zu infizieren und zu lysieren. Alle Puffer- und Nährstoffstammlösungen wurden mit hochreinem Wasser in Kunststoff-Laborgefäßen hergestellt, um die Ionenkontamination durch Glasgefäße zu minimieren. In LB gewonnene E. coli-Kulturen wurden vor der Beimpfung in Wachstumstests dreimal in 2x konzentriertem Medium gewaschen. Aus E. coli LB-Kulturen gereinigte T4- und MS2-Phagen wurden unter Verwendung von Slidealyzer-Kassetten (Pierce, Thermo-Fisher, Waltham, MA, USA) in 30 mM PIPES-Puffer pH 7 dialysiert, um restliche Ionen zu entfernen. Phagen wurden mit E. coli-Kulturen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von ~1 (108 Phagen pro 108 Bakterien) in 2x konzentriertem Wachstumsmedium gemischt. 40 μl Phagen und E. coli in 2x-Medium wurden dann in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (Costar, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) überführt, die 40 μl seriell verdünnte wässrige Lösungen anorganischer Ionen enthielten [30, 31]. Die Kulturen wurden bei 30 °C inkubiert und bei 700 U/min in einem Multitron-Schüttler/Inkubator (Infors, Annapolis Jn, MD, USA) geschüttelt. Nach 12 Stunden wurde die optische Dichte für die Dosis-Wirkungs-Analyse gemessen, wobei normalisierte Wachstumsdaten mit GraphPad Prism (Graphpad-Software, Boston, MA, USA) an eine nichtlineare Regressionskurve angepasst wurden, um die halbmaximalen Hemmkonzentrationen für die Wachstumshemmung zu bestimmen die E. coli aufgrund einer Phageninfektion (EC50) und Toxizität anorganischer Ionen (IC50).

Die in dieser Studie verwendeten Phagen sind in Abbildung S1 aufgeführt. Wir haben den Laborbestand an T4- und MS2-Phagen an den E. coli-Stämmen BW25113 bzw. C3000 unter Verwendung von Standardprotokollen angereichert [60]. Alle anderen Phagen wurden aus lokalen Abwasserproben (East Bay Municipal Utility District, Berkeley, CA) unter Verwendung von E. coli- und Citrobacter-Isolaten als Wirten gemäß dem Standardprotokoll zur Phagenisolierung isoliert (61). Der Phagentiter wurde geschätzt, indem eine 10-fache Reihenverdünnung jedes Phagen in SM-Puffer (Teknova) auf einen Rasen des Zielwirts aufgetragen wurde, wobei die Top-Agar-Overlay-Methode mit 0,7 % LB-Agar verwendet wurde. Für Phagenverdünnungen in Plaque-Assays verwendeten wir einen SM-Puffer, ergänzt mit 10 mM Calciumchlorid und Magnesiumsulfat (Sigma-Aldrich). Wir haben Phagen routinemäßig als filtersterilisierte (0,22 μm) Lysate bei 4 °C gelagert. Für die Genomsequenzierung wurde das Phagengenom mit dem Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI) extrahiert und in der Next-Generation-Sequencing-Kernanlage des Massachusetts General Hospital sequenziert. Die in dieser Studie verwendeten Genome sowohl von Phagen als auch von Bakterien sind Teil des NCBI BioProject Accession PRJNA576510.

Für die Transmissionselektronenmikroskopie-Bildgebung wurden 3 µl isolierter Bakteriophagen 5 Minuten lang auf ein 300 Mesh ultraleichtes, kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter aufgetragen. Das Gitter wurde kurz mit sterilem Wasser gewaschen und mit Filterpapier abgetupft, bevor es mit 3 µl 2 %igem wässrigem Uranylacetat gefärbt wurde. Nach 10 Sekunden wurde das Gitter bis zur Trockene abgetupft. Die Präparate wurden mit einem 120-kV-Transmissionselektronenmikroskop Jeol1400-FLASH im Lawrence Berkeley National Laboratory untersucht. Die Probe wurde mit der Oneview 16-Megapixel-Kamera (Gatan®) in einem Vergrößerungsbereich von 12 und 50 kX abgebildet.

Nitratreduzierende Anreicherungskulturen im Süßwasser wurden aus Glycerinvorräten in anoxischem, chemisch definiertem Basismedium gewonnen, ergänzt mit 2 Gramm/Liter Hefeextrakt als einziger organischer Kohlenstoffquelle und Elektronendonor und 20 mM Natriumnitrat als einzigem terminalen Elektronenakzeptor, wie zuvor beschrieben [14]. ]. Pro Liter enthaltenes Basalmedium: 1,5 g Natriumchlorid, 2,5 g Ammoniumchlorid, 10 g Natriumphosphat, 1 g Kaliumchlorid und 30 mM HEPES-Puffer mit Vitaminen und Mineralien aus 100x Stammlösungen. Pro Liter enthaltene Vitamin-Stammlösung: 10 mg Pyridoxin HCl, 5 mg 4-Aminobenzoesäure, 5 mg Liponsäure, 5 mg Nikotinsäure, 5 mg Riboflavin, 5 mg Thiamin HCl, 5 mg Calcium D, L-Pantothenat, 2 mg Biotin , 2 mg Folsäure, 0,1 mg Cyanocobalamin. Pro Liter enthaltene Mineralstoff-Stammlösung: 3 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 1,5 g Nitrilotriessigsäure, 1 g Natriumchlorid, 0,5291 g Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat, 0,05458 g Kobaltchlorid, 0,1 g Zinksulfat-Heptahydrat, 0,1 g Calciumchlorid-Dihydrat, 0,07153 g Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat, 0,02765 g Nickel(II)-Sulfat-Hexahydrat, 0,02 g Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat, 0,00683 g Kupfer(II)-Chlorid-Dihydrat, 0,01 g Borsäure, 0,01 g Natriummolybdat-Dihydrat, 0,000197 g Natriumselenit-Pentahydrat. Alle Chemikalien stammen von Sigma-Aldrich.

Um den Einfluss von Kohlenstoffquellen auf die Endprodukte der archivierten nitratreduzierenden Mikrobengemeinschaften zu messen, wurden Zellen aus gewonnenen Anreicherungskulturen bei 4000 RCF pelletiert und dreimal mit 2x konzentriertem Basalmedium ohne Kohlenstoffquelle gewaschen. Gewaschene Zellen wurden in 2x konzentriertem Basalmedium ohne Kohlenstoffquelle bis zu einer optischen Dichte (OD 600) von 0,04 resuspendiert und die Zellsuspension wurde entweder in 384-Well-Mikroplatten (Costar) oder 96-Deep-Well-Blöcke (Costar) mit 94 Kohlenstoffatomen überführt Quellen und Wasserkontrollen wurden angeordnet (Tabelle S1). Kohlenstoffquellen-Stammlösungen wurden mit einem Biomek FxP-Liquid-Handling-Roboter (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) zu Mikrotiterplatten gegeben und 48 Stunden lang in einer anaeroben Kammer (Coy, Coy Lab Products, Grass Lake, MI, USA) aufbewahrt vor der Inokulation anoxisch unter Verwendung eines Avidien Micropro 200-Pipettierers (Mettler-Toledo, Columbus, OH, USA). Inokulierte Mikroplatten wurden mit Silikon-Mikroplattendichtungen (VWR, Radnor, PA) versiegelt und bei 30 °C in einem Inkubator in einer anaeroben Kammer (COY) inkubiert. Das Wachstum wurde anhand der optischen Dichte (OD 600) unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts Tecan M1000 Pro (Tecan Group Ltd., Männendorf, Schweiz) überwacht und die Kulturen wurden nach 48 Stunden für die DNA-Sequenzierung und kolorimetrische Tests zur Messung von Ammonium geerntet.

Um den Einfluss anorganischer Ionen auf die Wirksamkeit des Phagencocktails zu messen, wurden die Phagen wie oben beschrieben in einen Puffer mit niedriger Ionenstärke dialysiert und mit der gewaschenen Anreicherungskultur und Kulturen, die 20 mM D-Trehalose und 20 mM Natriumnitrat enthielten, in Gegenwart von gemischt seriell verdünnte Lösungen von Calciumchlorid oder Natriumchlorid. Wie oben wurde die Kultur vor der Messung der optischen Dichte und des Ammoniums 48 Stunden lang inkubiert.

Die Ammoniumproduktion wurde wie zuvor beschrieben gemessen [14]. Mikroplattenversiegelungen wurden von Mikroplatten mit 384 Vertiefungen, die Anreicherungskulturen enthielten, entfernt und ein Biomek FxP (Beckman Coulter) wurde verwendet, um 4 µL der Kultur auf Test-Mikroplatten zu übertragen, die mit 20 µL destilliertem entionisiertem Produkt vorgefüllt waren. Nacheinander wurden 4 µL Citrat-Reagens, 8 µL Salicylat/Nitroprussid-Reagens und 4 µL Bleichreagenz zu den Testplatten gegeben, die dann 30 Minuten lang bei 30 °C gehalten wurden. Citrat-Reagenz enthält 10 g Trinatriumcitrat und 4 g Natriumhydroxid in 200 ml Wasser. Salicylat/Nitroprussid-Reagenz enthält 15,626 g Natriumsalicylat und 0,250 g Natriumnitroprussid in 200 ml Wasser bei pH 6–7. Bleichreagenz enthält 1 g einbasiges Natriumphosphat, 2 ml 2 M Natriumhydroxid, 10 ml Bleichmittel (0,7 M NaOCl, Chlorox Company, Pleasanton, CA, USA) in 100 ml Wasser bei pH 12–13. Für alle kolorimetrischen Tests haben wir bestätigt, dass die Beeinträchtigung durch Medienzusätze (Kohlenstoffquellen und anorganische Ionen) vernachlässigbar war. Unter Verwendung von Konstanten aus der BioNumbers-Datenbank [62] haben wir die in die Biomasse assimilierte Stickstoffmenge geschätzt, indem wir 0,3 g/L Trockengewicht der Bakterienkultur bei OD 600 = 1 angenommen haben [63, 64] und 12 % Stickstoff angenommen haben Gewicht der mikrobiellen Biomasse basierend auf gemessenen C:N:P-Verhältnissen [65, 66].

Zur DNA-Extraktion wurden mikrobielle Zellen aus 500-µL-Kulturen durch Zentrifugation bei 4000 RCF nach 48-stündigem Wachstum bei 30 °C pelletiert. DNA-Extraktionen (gDNA) wurden wie folgt durchgeführt. Zellpellets wurden in 180 µL enzymatischem Lysepuffer (ELB) resuspendiert, der 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Natrium-EDTA (TE) mit 1,2 % Triton X-100 enthält. 20 µL Lyzosym (25 mg/ml) wurden hinzugefügt und die Proben über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden 20 µL Proteinase K (20 mg/ml) und 200 µL 4 M Guanidinium-HCL zugegeben und die Proben über Nacht bei 55 °C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden 4 µL RNAse A (100 mg/ml) zugegeben und die Proben 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. 200 µl Ethanol wurden zugegeben, um die DNA auszufällen, und die Proben wurden dann auf 96-Well-Silica-Membranplatten (BPI-Tech, San Diego, CA, USA) aufgetragen. An Membranen gebundene DNA wurde zweimal mit 400 µL 70 % Ethanol:TE gewaschen und in 100 µL TE eluiert. Ein Avidien Micropro 200 (Avidien) wurde zum Übertragen großer Puffermengen und Mehrkanalpipetten (Rainin) zum Auftragen von Proben auf 96-Well-Säulen und zum Hinzufügen von Reagenzien mit geringem Volumen verwendet. Zur Durchführung der Säulenreinigungsschritte wurde ein Vakuumverteiler (Qiagen, Redwood City, CA, USA) verwendet. Es wurde festgestellt, dass Extraktionen mit dieser Methode hinsichtlich der DNA-Ausbeute und -Ausbeute denen mit dem Gene QIAamp 96 DNA QIAcube HT Kit (Qiagen) ähneln.

Eine gDNA-Matrize wurde einer PCR-Reaktion hinzugefügt, um die V4/V5-16S-Genregion unter Verwendung der 515F/926R-Primer zu amplifizieren, die auf den Primern des Earth Microbiome Project basieren [67, 68], jedoch mit dualen Inline-Illumina-Indizes [69, 70]. Die Amplikons wurden auf einem Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) in der QB3 Genomics-Einrichtung (QB3 Genomics, UC Berkeley, Berkeley, CA, RRID:SCR_022170) mit 2 × 300 bp Ilumina v3-Reagenzien sequenziert. Lesevorgänge wurden mit benutzerdefinierten Perl-Skripten verarbeitet, die Pear zum Zusammenführen von Lesevorgängen [71], USearch [72] zum Filtern von Lesevorgängen mit mehr als einem erwarteten Fehler, Demultiplexing mithilfe von Inline-Indizes und Unoise [73] zum Filtern seltener Lesevorgänge und Chimären implementierten. 16S-Sequenzen in der Tabelle der relativen Häufigkeit wurden anhand der RDP-Datenbank (74) durchsucht, um eine Taxonomie zuzuordnen. Die Funktionsfähigkeit für enzymatische Nitratreduktionsschritte wurde in einer früheren Veröffentlichung bestimmt [14]. Die nächstgelegenen 16S-rDNA-ESVs aus der 16S-Taxonomie wurden den taxonomischen Bins von GTDB-Tk [75] zugeordnet [14].

DNA-Sequenzierungsdaten sind unter BioProject Accession PRJNA576510 verfügbar.

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Diese Arbeit wurde von ENIGMA finanziert, einem wissenschaftlichen Schwerpunktprogramm, das vom US-Energieministerium, dem Office of Science, dem Office of Biological and Environmental Research, Genomics: GTL Foundational Science durch den Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen dem Lawrence Berkeley National Laboratory und dem unterstützt wird US-Energieministerium. Der erste Teil dieser Forschung wurde vom DOE Office of Science durch das National Virtual Biotechnology Laboratory unterstützt, einem Konsortium nationaler DOE-Labors, die sich auf die Reaktion auf COVID-19 konzentrieren, mit Mitteln aus dem Coronavirus CARES Act.

Abteilung für Umweltgenomik und Systembiologie, Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA, 94720, USA

Hans K. Carlson, Madeline L. Moore, Roniya T. Magar, Adam M. Deutschbauer, Adam P. Arkin und Vivek K. Mutalik

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, 94720, USA

Denish Piya und Adam P. Arkin

Abteilung für Molekulare Biophysik und integrierte Biobildgebung, Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA, 94720, USA

Nathalie H. Elisabeth

Abteilung für Pflanzen- und Mikrobenbiologie, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, 94720, USA

Adam M. Deutschbauer

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HKC und VKM konzipierten die Experimente und verfassten das Manuskript. HKC, VKM, DP, MLM, NLE und RTP führten Experimente durch. Alle Autoren haben das Manuskript redigiert und überarbeitet.

Korrespondenz mit Hans K. Carlson oder Vivek K. Mutalik.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Carlson, HK, Piya, D., Moore, ML et al. Geochemische Einschränkungen der Bakteriophagen-Infektiosität in terrestrischen Umgebungen. ISME COMMUN. 3, 78 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00297-7

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Eingegangen: 23. Juni 2023

Überarbeitet: 26. Juli 2023

Angenommen: 10. August 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00297-7

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